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        Jackson ImmunoResearch:側流免疫層析 (試紙條)

        發布者:艾美捷科技    發布時間:2022-05-25     
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        概述
        介紹
        側流免疫層析常見形式
        關鍵試劑
        經典側流免疫層析分析的構建
        將試劑應用到 LFIA 設備的組件上
        試紙條組裝
        開發用于人IgG檢測的側流免疫
        結果
        參考

        側流免疫層析 (試紙條)

         

        介紹

        側流免疫層析(lateral flow immunochromatography assay,LFIA;也簡稱為側向層析)是一種基于抗原、抗體免疫反應的經典床旁檢測技術(point of care testing,POCT)。側流免疫層析試紙條,是一種在不使用實驗室設備的情況下確認目標分析物是否存在的簡易便攜裝置,作為是一種低成本、直接的方法,被廣泛應用于檢測人類和動物的感染或生物標志物,以及水、食物和動物飼料中的污染物和有害物質。

         

        側流免疫層析

         

        側流免疫層析常見形式

        側流免疫層析的3種常見形式:直接法(圖1)、夾心法(圖2)和競爭法(圖3)。每個測試都是以線性條帶形式運行的,由分離和檢測感興趣的分析物所需的材料制成,并提供一個對照反應以確認測試的正確進行。下面的例子概述了側流免疫層析的基本原理,并簡要地強調了條帶的組成部分和它們的功能。

        側流免疫層析直接法

        側流免疫層析夾心法

        側流免疫層析競爭法

        圖1,直接法:用于檢測人類抗體圖2,夾心法:用于檢測生物液體中的抗原圖3,競爭法:用于樣品中藥物或危險化學品的存在

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        關鍵試劑

        抗體 - 親和力和特異性

        選擇正確的抗體是開發成功的側向流動免疫測定法的關鍵因素。

        “如果沒有認真測試篩選合適的抗體,那么再多的優化都無法克服這種固有的缺陷”(Brown,2008 年)

         

        親和力

        親和力特別重要,因為抗原的相對豐度可能很低。由于抗原、抗體偶聯物和包被的抗體在測試條的分析區域中相互作用僅幾秒鐘,因此需要快速的 kon速率和慢的 koff速率。

         

        特異性

        抗體必須能特異性地識別目標抗原,而不能檢測類似或同源的蛋白質和分子。由于在LFIA測試中使用了高濃度的抗體通常比ELISA板孔中的抗體濃度高25-100倍,出色的特異性也是至關重要的。膠體金抗體偶聯物通常以每次30-250ng的量被使用。如果假設樣品在10-50ul內使標記的抗體再水化,那么抗體結合物的濃度將在0.6到20ug/ml之間。在較高的濃度下,抗體可能是其Kd的100倍,這可能會促使結合力弱、特異性低的抗體產生非特異性的相互作用,從而導致假陽性。

         

        抗體供應

        LFIA 的抗體可以在內部制造或從商業來源購買。

         

        數量

        首先要考慮的因素之一是啟動和維持商業產品所需的數量。如果每條帶 1ug 的捕獲抗體并希望制作 100 萬條,則所需的抗體量至少為 1g。因此,確保供應商能夠以一致的質量生產大批量產品至關重要。如果要在內部制造抗體,則必須注意選擇合適的抗原、免疫方法、篩選策略和放大工藝。

         

        克隆性

        單克隆抗體

        單克隆抗體 (MAb) 的開發和生產是獲得具有所需屬性和保證質量穩定的抗體的有效方法。然而,在體外條件下的放大可能會很昂貴,并且在純化運行之間可能會出現批次間的差異。篩選單克隆抗體以識別那些在膜結合、標記和與最終測定中使用的其他抗體一起表現良好的單克隆抗體也很重要??贵w在與膜結合時作為捕獲劑工作良好,但在與報告分子結合時表現不佳的情況并不少見。最后,篩選還必須識別在實驗條件下識別檢測形式中表位的抗體,例如緩沖液成分或抗原的構象結構。

         

        多克隆抗體

        多克隆抗體 (PAb) 的生產很容易擴大規模,無論是使用兔子、山羊、雞還是驢作為宿主動物。PAb 的另一個優點是它們也可用于實現更高的檢測靈敏度。作為IgG的混合物,每種IgG同時和組合識別抗原上的不同表位,它們允許沉積更多的報告分子,從而增加信號。PAb 可能存在批次間差異,但由于它們是由宿主動物的免疫系統產生的,可能會隨著時間而改變。

         

        驗證

        無論來源或制造方法如何,都需要使用相應的工作流程來檢驗,以確保測試的一致性和可重復性。

         

        對照線/質控線—抗體(Control Reagents)

        雖然開發或選擇合適的捕獲和檢測抗體對檢測的性能至關重要,但在LFIA中使用的控制試劑的選擇也很重要。與報告分子偶聯的IgG或二抗通常被用來設置必要的對照線/質控線,以確保測試的正確可信。例如,陽性對照線可以用抗雞的二級抗體,該抗體與偶聯的雞IgY結合。雞IgY經常被使用,因為與哺乳動物IgG相比,雞IgG的同源性和序列特征較低,因此產生的非特異性相互作用較少。對照線抗體也應該與LFIA中使用的其他抗體有最小的交叉反應,因為如果測試中使用的IgG或樣品中存在的IgG干擾了對照試劑的結合,那么對照線的強度就會有很大的變化。

         

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        常見抗雞二抗預覽

        抗雞二抗

         

        用于血清學測試的捕獲抗體和檢測抗體

         

        血清學LFIA,使用抗體來捕獲或檢測由患者免疫反應產生的IgG。在血清學LFIAs中,檢測線是涂有抗原的,而病人的樣本中含有特定同型的抗原IgG,通過與病人血液中的IgG結合,而產生信號,該抗體與檢測線上的抗原相結合(見圖1)。檢測抗體的特異性很關鍵,它不應該與檢測中使用的其他物種的抗體或其他同種型的抗體結合。例如,在獨立檢測IgG和IgM同種型的檢測中,抗IgG抗體不能與IgM發生交叉反應,而抗IgM抗體不能檢測IgG。

         

        報告分子與偶聯物

        常用于側流免疫層析的報告分子包括膠體金、乳膠珠和熒光染料。每種選擇都有明顯的優勢,選擇取決于檢測目標和檢測讀出方法。其他標簽包括順磁顆粒、酶、量子點、纖維素納米珠、納米金、二氧化硅納米顆粒、生物發光和發光材料,以及上轉換熒光劑(Goryacheva等,2013,Quesada-González & Merko?i,2015,和(Guo等,2021)。在此閱讀更多關于報告分子與偶聯物的信息。

         

        膠體金(Colloidal Gold)

        膠體金是一種廣泛用于LFIA的偶聯物,因為它能產生強烈的顏色,易于偶聯,并且它的質量穩定。典型的尺寸在40-80nm之間,其中40nm是最常見的。

        金顆粒與抗體的結合通常是通過靜電和疏水的相互作用被動進行的。這兩個實體在低離子強度的緩沖液中混合,然后用多元醇或蛋白質如白蛋白或酪蛋白進行封閉。膠體金也有活化的表面,如羧基,允許在必要時進行共價連接。

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        乳膠微粒

        乳膠顆粒用途廣泛,自其最初開發以來一直被用于側向流檢測。顆??梢匝b載彩色和/或熒光染料、順磁顆粒和其他化學品。不同顏色的染料可以進行多種同時讀出的檢測。用于LFIA的標準尺寸范圍為100-300um。綴合方法在吸附或共價連接之間變化,取決于表面化學。乳膠珠的敏感度可能低于膠體金,因為它們的大尺寸使它們不能密集地包裝在測試或控制線上。

         

        熒光染料

        熒光染料作為標簽得到了青睞;作為小分子(<1nm),它們比較大的納米顆粒更容易從偶聯墊中釋放出來。染料有助于通過一個LFIA設備對多種分析物進行定量和檢測(Wild,2016),盡管它們需要使用特殊的閱讀設備來顯示結果并充分利用染料的特性。適用于LFIAs的熒光團應該是經濟的,具有長斯托克斯位移,良好的量子產率,并且是光穩定的。染料有多種形式,便于與蛋白質和小分子上的伯胺和巰基共價偶聯。熒光素Fluorescein 和Cyanine染料是流行的選擇。

         

        一些染料可能不適合用于LFIA,因為在高濃度下會出現光漂白或淬滅。結合活性可能會因為發生在抗體副體或目標表位的關鍵點上的共價偶聯而受到影響,或者因為疏水性染料引起的聚集。

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        經典側流免疫層析分析的構建

        任何LFIA的成功也取決于其材料成分,(圖4),制造商通常使用不同的專有方法和試劑進行生產。出于這個原因,應該對來自不同來源的材料進行評估,以確保開發出準確和可靠的測試。測試優化是一個反復的過程,可能需要幾個月才能完成。下文簡要介紹了每個組成部分,并考慮了它們在生產有效的LFIA中的重要性。

        經典側流免疫層析分析組成

        圖4

         

        樣品墊

        LFIA的第一步是通過樣品墊將樣品引入設備(圖4)。樣品墊材料的選擇取決于標本的性質和被檢測的分析物。樣品墊能分離過濾樣品中的雜質,對樣品進行前處理,平衡待測試樣品的PH和調整鹽離子強度,使樣品在層析過程中保持一定的均一性和可控性。樣品墊的材料主要選擇玻纖、無紡布和濾紙。

         

        偶聯墊(結合墊)

        樣品中自由流動的物質從樣品墊遷移到偶聯墊。偶聯墊是抗體和其他蛋白質或與報告分子(如膠體金、彩色乳膠顆?;驘晒馊玖希└街妮d體??梢蕴砑宇~外的成分,如糖類,以確保干燥的浸漬試劑在環境溫度下的穩定性,并延長保質期。當樣品移入偶聯墊時,偶聯物被重新水化并與樣品成分相互作用。然后它們移到膜上,膜稍微重疊。偶聯墊通常由玻璃纖維、聚酯纖維或人造纖維制成。

         

        試劑-樣品混合物通過膜遷移,免疫測定完成并可視化。 LFIA 中使用的膜會影響靈敏度、速度和整體背景(Huang 等人,2016 年和 Wild & Mansfield,2016 年)。 更快的流速可以降低背景,但會影響靈敏度,導致假陰性。 當由于分析物駐留時間增加而需要高靈敏度時,使用較慢的芯吸速率。 緩慢的芯吸速率可能會導致假陽性信號,因為不充分特異性的抗體會導致較高的背景。

         

        硝酸纖維素膜(NC膜)因其高蛋白質結合能力和廣泛的可用性而被普遍使用。 膜制造商添加專有的表面活性劑、潤濕劑和其他化學品來控制蛋白質結合和芯吸速率,從而實現一致的分析性能。

         

        硝酸纖維素膜(NC膜)

         

        膜的干燥與封閉

        應用在硝酸纖維素膜上的抗體通過親水相互作用在接觸時結合??贵w在應用點上結合,而不會隨緩沖液擴散。涂抹抗體后,水在40°C的強制空氣下揮發,抗體通過疏水作用固化在膜上。如果需要的話,膜的封閉通過浸泡在封閉緩沖液中,然后再進行干燥。有效的干燥對LFIA的性能至關重要,因為它確保了生物分子的穩定性和均勻的再濕潤。包被的材料應在精心控制的溫度和約20%濕度下儲存。

         

        吸水墊

        位于側流試紙條遠端的吸水墊,將硝化纖維膜上的載液/緩沖液從測試線和對照線吸到試紙條的末端。樣品和偶聯物繼續被吸入測試條,直到沒有更多的液體可以被吸走,或者吸液墊變得飽和。高密度纖維素常被用于此目的。

         

        將試劑應用到 LFIA 設備的組件上

        為了確保LFIA的可預測和可重復性,抗體、抗原、緩沖鹽和結合物應該以統一和可重復的方式應用到膜或墊上。根據包被材料,或開發或制造過程的階段,可以使用各種方法。LFIA制造需要能夠產生一致的流動特性的設備和能夠實現高產量的應用方法。

         

        浸沒

        通過將墊浸入含有這些成分的溶液中,然后吸干和干燥緩沖劑、封閉劑和偶聯物等材料。

        Tips: 將抗體和蛋白質應用于膜或偶聯墊需要更高的精度,以獲得生產批次之間的均勻性;因此,專門的點膠設備是必要的。

         

        氣動接觸分液器

        氣動接觸分液器通過泵送材料,使材料通過與膜或偶聯墊接觸的柔性點膠頭,來分液。點膠頭和膜的相對移動,沿著材料形成一條均勻的試劑線。接觸式分液器通常很經濟,而且可以在小空間內容納。然而,它們會損壞膜,而且在大規模的生產操作中可能難以控制。因此,它們通常在研究和開發過程中使用,在這種情況下,需要低量的條狀物來進行檢測優化。

         

        氣動接觸分液器

         

        非接觸式噴點器

        非接觸式噴點設備,如噴筆或噴墨液滴噴點器,利用高精度的泵來輸送低至1nL大小的液滴,可以形成小至200um寬的線條/條紋。強制空氣也可以被引入,以達到類似于藝術家的噴筆噴霧的效果。這兩種非接觸方法都可以分配試劑,其CV值或優于+/-1%,適合于大規模生產。

         

        試紙條組裝

        LFIA的材料成分被層壓在一個涂有粘合劑的柔性塑料背板上,以提供硬度,從而使測試條能夠被輕易地處理。在每個材料的接口處有足夠的重疊,最小為2毫米,這是必要的,這樣樣品液體就可以從一個部分無縫地流向另一個部分。當材料被應用到背板上時,要使用均勻的壓力以確保樣品沿著測試條均勻地流動。這個 "卡片 "組裝好后,條狀物被切割成大約5mm的一致寬度。然后,測試條可以被放入精心設計和成型的塑料外殼中,以確保使用者在正確的區域加入樣品,并實現適當的流動。塑料外殼中還包括一個帶有適當標記的窗口,以方便結果的正確讀取。

         

        半條測試

        測試條不需要與樣品或結合物墊一起組裝。以這種方式構建的試紙條通常被稱為 "半條"。它們通常在開發過程中用于篩選抗體、偶聯物和其他試劑。在試管或96孔板中混合少量的樣品和報告偶聯物,例如50uL,然后將半條帶的自由膜端放入溶液中?;旌衔镌诿氉饔孟卵刂鴹l帶向上遷移,最終到達吸水墊。該條帶可以被移除并讀取,或者轉移到含有其他溶液的試管中,這些溶液被抽吸起來,直到吸水墊飽和。

        在介紹了側流免疫分析的形式和結構后,下面將介紹一個簡單的檢測人IgG和IgM的開發實例。

         

        開發用于人IgG檢測的側流免疫

        血清學檢測能夠對疾病進行監測,從最初的感染一直到免疫力的產生。血清學檢驗的是對病人體內抗體的特異性檢測。側流免疫分析法被廣泛用于檢測人類IgG。在這里,我們展示了Jackson ImmunoResearch公司的抗人類同種型特異性抗體在LFIA格式中的效用。

         

        摘要

        構建了一個基于半條形側流免疫層析實驗的雙抗夾心法,專門檢測人血清中的人IgG與IgM。需要設置對照線,以確保測試的正確進行。下圖(圖5)表示了檢測的設置和指示陽性檢測的交互作用。

         

        關鍵檢測試劑

        捕獲人IgG山羊抗人IgG, Fcγ fragment specific (min X Bov, Ms, Rb Sr Prot) (109-005-170)
        檢測人IgG40nm膠體金偶聯山羊抗人IgG, Fcγ fragment specific (min X Bov, Ms, Rb Sr Prt) (109-405-170), 與IgG的各亞型結合,具有特異性,與人類IgM的交叉反應性最小。
        捕獲人IgM山羊抗人IgM, Fc5u fragment specific (min X Bov Sr Prot) (109-005-129)
        檢測人IgM40nm膠體金偶聯山羊抗人IgM, Fc5u fragment specific (min X Bov Sr Prot) (109-405-129). 這個抗體同樣極具特異性,且與上述捕獲人IgG試劑(109-005-170)交叉反應最小。

         

        陽性對照

        捕獲驢抗雞IgY (IgG) (H+L) (min X Bov, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat, Shp Sr Prot) (709-005-155)
        檢測40nm膠體金偶聯ChromPure Chicken IgY (003-400-003)
        封閉牛血清白蛋白,無IgG,無蛋白酶(001-000-161)

         

        試劑使用

        抗體被涂在Whatman FF170HP硝酸纖維素膜上,以產生反映典型LFIA流動特征的條帶。捕獲抗體在PBS中稀釋至0.3mg/ml,并以60ul/min的速度連續分配到以10mm/s速度移動的膜上。通過使用注射泵,通過與膜直接接觸的PEEK管來控制分配速度。剝離后,膜在40°C強制空氣下干燥,然后將膜浸入1%的BSA在PBS中的溶液中封閉1小時,接著清洗,然后在40°C強制空氣下干燥過夜。

         

        LFIA半條帶組裝

        干燥后,將膜貼在自粘性底板上,并加入纖維素吸水墊(Ahlstrom 222級),與硝酸纖維素膜重疊約2mm。膜被切割成0.5cm的單獨條帶,在使用前被放置在含有干燥劑的干燥器中至少48小時。

         

        方法概述

        捕獲抗體在硝酸纖維素NC膜進行條帶化,得到每線性cm含有 0.3ug 抗體的線:

        IgG 測試線:山羊抗人 IgG,Fcγ 片段特異性(min X Bov,Ms,Rb Sr Prot)(109-005-170) ;

        IgM 測試線:山羊抗人 IgM,Fc5u 片段特異性 (min X Bov Sr Prot) (109-005-129) ;

        對照測試線:驢抗雞 IgY (IgG) (H+L) (min X Bov , Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat, Shp Sr Prot) (709-005-155)。

        用 PBS 中的 1% 牛血清白蛋白(無 IgG,無蛋白酶)(001-000-162) 封閉膜,然后干燥并應用芯吸墊。

         

        將側向流動測試條置于 50 ul 混合物中,其中包含檢測抗體:40 nm 金偶聯物,0.8 OD520/ml ChromPure 雞 IgY (IgG)-全分子 (003-400-003)、山羊抗人 IgM、Fc5u片段特異性 (min X Bov Sr Prot) (109-405-129) 和山羊抗人 IgG, Fcγ 片段特異性 (min X Bov, Hrs, Ms Sr Prot) (109-405-098)。

         

        其他孔也加入了 50 ng 純化的人IgG:ChromPure 人 IgG,全分子 (009-000-003) 和 ChromPure 人 IgM(myeloma),全分子 (009-000-012) 或使用PBS 1:200稀釋的人血清。運行測試 15 分鐘后,將試紙轉移到含有 PBS 的孔中以去除多余的金結合物。

         

        結果

        用于側向流檢測的抗人類多克隆抗體

        側向流檢測的抗人類多克隆抗體

        圖5

         

        所有的測試都是在96孔板中進行的,時間不到20分鐘。試劑的濃度和其他參數需要優化。這些參數包括:捕獲抗體、檢測偶聯物、測定緩沖液條件以及需要封閉膜。最終條件詳見方法概要。

         

        捕獲抗體和檢測抗體產生了強烈的陽性測試線,表明在人血清存在的情況下檢測特定的IgG同種型。雖然這里沒有顯示,但在這種形式下也能檢測到亞ng的人類IgG。

        然而,使用純人血清確實產生了 "HOOK效應",導致樣品在血清中的濃度越高,信號就越少,因此在使用前必須將血清在PBS中稀釋1: 200。通過使用大量的金結合物可以避免稀釋,但這可能會導致結果解釋上的困難,并且需要追隨緩沖液清洗步驟來幫助分析。本實驗中包括一個洗膜步驟以提高清晰度。

        在生理條件下用BSA封閉和用Tween 20緩沖,改善了樣品的流動性。纖維素吸水墊非常有效,如果長時間放置,可使整個樣品被吸走。

        這個簡短的案例研究表明,Jackson抗體適用于檢測人血清中的特定IgG同種型,證明它們適合用于POCT檢測中側流免疫層析產品的開發。

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        參考

        Bishop, J.D. et al., 2019. Sensitivity enhancement in lateral flow assays: a systems perspective. Lab on a Chip, 19(15), pp.2486–2499.

        Brown, M.C., 2008. Antibodies: Key to a Robust Lateral Flow Immunoassay. Lateral Flow Immunoassay, pp.1–16.

        Goryacheva, I.Y., Lenain, P. & Saeger, S.D., 2013. Nanosized labels for rapid immunotests. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 46, pp.30–43.

        Guo, J. et al., 2021. Nanomaterial Labels in Lateral Flow Immunoassays for Point-of-Care-Testing. Journal of Materials Science & Technology, 60, pp.90–104.

        Huang, X. & El-Sayed, M.A., 2010. Gold nanoparticles: Optical properties and implementations in cancer diagnosis and photothermal therapy. Journal of Advanced Research, 1(1), pp.13–28.

        Huang, X. et al., 2016. Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review. Biosensors and Bioelectronics, 75, pp.166–180.

        Quesada-González, D. & Merko?i, A., 2015. Nanoparticle-based lateral flow biosensors. Biosensors and Bioelectronics, 73, pp.47–63.

        Vashist, S.K., Luong, J. & Amerongen, A.V., 2018. Lateral Flow Immunoassays. In Handbook of immunoassay technologies: approaches, performances, and applications. London: Elsevier/Academic Press, pp. 172–173.

        Wild, D., 2016. Lateral flow immunoassay systems. In The immunoassay handbook: theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. Amsterdam ; Boston ; Heidelberg ; London ; New York ; Oxford ; Paris ; San Diego ; San Francisco ; Singapore ; Sydney ; Tokyo: Elsevier, pp. 89–107.

        Wild, D. & Mansfield, M.A., 2016. Nitrocellulose Membranes for Lateral Flow Immunoassays:A technical Treatise. In The immunoassay handbook: theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. Amsterdam ; Boston ; Heidelberg ; London ; New York ; Oxford ; Paris ; San Diego ; San Francisco ; Singapore ; Sydney ; Tokyo: Elsevier, pp. 95–113.

         

        * 本文自Jackson官網專欄漢化,英文原文可聯系艾美捷客服索取

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