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        同源重組構建質粒原理詳解

        發布者:艾美捷科技    發布時間:2021-11-09     
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        分子生物學研究中質粒構建是最常用的實驗技術。原理依賴于限制性核酸內切酶,DNA 連接酶和其他修飾酶的作用,分別對目的基因和載體 DNA 進行適當切割和修飾后,將二者連接在一起,再導入宿主細胞,實現目的基因在宿主細胞內的正確表達。

        同源重組的基因克隆方法, 相比雙酶切載體構建方法,該方法的構建過程有些不同,雙酶切構建過程比較繁瑣,同源重組構建過程相對簡單,可以省去很多的時間和精力,但假陽性率略高。


        同源重組法構建載體

        首先,靶基因片段擴增引物有別于常規引物設計;

        其次,載體切割過程中只需要進行單酶切;

        第三,載體和目的基因片段的連接是基于同源重組而不是粘性末端互補。

         

        采用同源重組法構建載體與常規雙酶切構建載體方法不同。

        首先,設計引物時上游引物5’端前面加的是酶切位點(如Hind III)及該酶切位點在pMIR reporter載體中對應前面的15個堿基載體片段,下游引物5’端前面加的是Hind III酶切位點及該酶切位點在pMIR reporter載體中對應后面的15個堿基載體片段,如此設計引物是為了保證目的片段插入載體時方向正確。

        其次,載體只需要單酶切,用Hind III酶切pMIR reporter,使得pMIR reporter成為兩端都帶著Hind III位點的線性載體。相比雙酶切切割載體,單酶切可以保證酶切后的載體都是單一的線性片段,使得后續的重組連接更準確。

        第三,省去了TA克隆環節。因為PCR產物可以直接用于重組連接,不需要酶切產生粘性末端,而且重組酶的重組能力強于T4 DNA連接酶的連接能力,一般只需要一步即可重組連接成功,因此可以在重組反應之后進行測序鑒定。


        詳解:

        基于同源基因重組原理,適用于向幾乎任何載體在任何位點進行定向克隆,無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點可高效克隆 50 bp~10 kb 片段,同時構建時間也大大縮短。


        1. 載體的制備一般推薦雙酶切線性化,線性化完全,假陽性克隆低。酶切體系同上。


        2. 對于使用重組方式連接來說,PCR 要設計引物, 設計引物時要根據質粒載體和基因序列選擇合適的同源序列,通過 PCR 擴增方式進行連接,PCR 的產物要純化。


        引物設計原則簡單總結一下:

        (1)前向引物:5’ 端--上游克隆載體末端同源序列+基因正向擴增引物--3’ 端

        (2)反向引物:3’ 端--基因反向擴增引物+下游克隆載體末端同源序列--5’ 端


        如果設計的基因特異插入片段擴增產物長度較長,可以選擇 PCR 方式進行目的引物的擴增。


        [可選 PCR 擴增體系]

        ddH2O                       14 ul

        10 x Taq buffer           2 ul

        10 um DNTP              1 ul

        10 um primer F          0.5 ul

        10 um primer R          0.5 ul

        Vector                        1 ul

        Taq 酶                        1 ul


        [可選 PCR 擴增條件]

        (1)95℃:5min

        (2) 35cycle

        95℃:30s

        55℃:30s(退火溫度可以根據目的引物TM值決定,一般退火溫度根 據引物TM值降低5度)

        72℃:40s

        (3)72℃:10min

        (4)16℃:hold

        PCR 擴增后,通過膠回收方式獲得純化的 PCR 產物。純化后的 PCR 產物不需要進行酶切,直接用于重組反應。


        3. 目的引物與線性載體進行重組反應。


        [可選重組體系]

        5 × CE II Buffer           4 μl

        線性化克隆載體          50~200 ng

        插入片段擴增產物      20~200 ng

        ExnaseII                  2 μl

        ddH2O                        x ul


        在冰水浴中配制,配制完成后,用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分,置于 37 ℃ 反應 30 min。待反應完成后,立即將反應管置于冰水浴中冷卻 5 min。重組效率在反應 30 min 左右達到最高,反應時間不足或者太長都將會降低克隆效率,這樣大大減少了連接時間。


        4. 轉化

        將連接產物轉化到受體菌中(一般為 DH5a),涂板,培養過夜。


        5. 挑取單克隆,并鑒定

        挑去平板上的單克隆培養,可以通過 PCR 或者酶切初步鑒定陽性克隆,對初步鑒定出來的陽性克隆進行測序。


        最后,幾個主要注意事項:

        1. 載體克隆位點選擇盡量選擇無重復序列,且 GC 含量比較均勻的區域進行克隆。當克隆位點上下游 20 bp 區域內 GC 含量均在 40%~60% 范圍之內時, 克隆效率將達到最大.

        2. 最適克隆載體與插入片段摩爾比為 1:2,即最適插入片段使用量為 0.06 pmol。這些摩爾數對應的 DNA 質量可由以下公式粗略計算獲得:

        最適克隆載體使用量 = [0.02 × 克隆載體堿基對數] ng(0.03 pmol)

        最適插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段堿基對數] ng(0.06 pmol)

        3. 雙酶切 1 和 2,在設置酶切體系時要考慮酶切溫度以及 Activity in NEBbuffer 的問題。


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